技术介绍丨基于组织底物的实验(TBA)知识全览：荧光模式、抗体对应与CBA联合应用什么是TBA检测 免疫荧光技术按照分类可以分为直接免疫荧光(DIF)和间接免疫荧光(IIF)（图1）。其中间接免疫荧光法利用基质中的相应抗原与待测样本中的抗体进行反应后，而后加入荧光标记的二抗，从而检测样本中的抗体。按照底物的不同，可以分为基于组织底物的实验(tissue-based assay，TBA)（图2）和基于细胞底物的实验(cell-based assay，CBA)（图3），对抗体进行筛查和鉴定。 图1：免疫荧光技术 图2：TBA检测示意图 图3：CBA检测示意图 TBA检测和CBA检测的比较 TBA怎么结合CBA进行应用？ 采用 TBA 与 CBA 联合检测，这样有助于两种方法的相互比对确认，可以相互验证、相互补充。 神经内科TBA常见的检测底物有哪些 TBA选用的组织来源可以为大鼠、小鼠及猴，神经内科常用的组织以脑组织（小脑、海马）为主。 TBA法是应用含有数千万计抗原蛋白的切片，切片中的抗原与人的抗原具有同源性，人的抗体能够识别切片中的抗原，并与之相结合，把非特异性抗体洗掉后加入荧光标记的二抗，就可以看到结合的具体位置，根据经验进行推断，主要观察两种细胞抗体，即神经细胞抗体和胶质细胞抗体。 图4：中枢神经系统常见的胶质细胞 临床上，虽然大鼠、小鼠组织基质较易获得，价格较优惠，而猴组织基质的相对较贵，但是猴与人的遗传距离更近，建议优先选择猴组织为基质检测。 神经内科中TBA检测注意事项 排除非神经特异性的抗体干扰： 因为组织中存在各种非神经特异性的抗原成分，可能与样本中的其他自身抗体结合，影响免疫荧光的结果判读。例如健康人也可以存在抗核抗体，或者患者合并的其他自身免疫性疾病而伴有抗其他组织的自身抗体，这些抗体都可能影响免疫荧光形式，干扰结果的判读。所以临床需要排除这些干扰来解读TBA结果。 明确荧光结果与抗体不是一一对应关系： TBA的读片与结果判读具有一定挑战性，多种抗体可以表现为同一荧光形式。比如，“美杜莎共济失调”的组织荧光形式的抗体有10余种，各种荧光形式之间有时很难完全区分，有时需要结合其他组织的荧光形式进行判断，或者可以结合CBA进行验证。 TBA检测结果展示 (含不同组织和细节) ◆ 小脑组织： 小脑组织结构如图5所示，小脑皮质（cerebellar cortex)为位于小脑表面的灰质，小脑皮质从外到内明确地分为三层：小脑分子层（CB-ML）、小脑浦肯野细胞层（CB-PL/PC）、小脑颗粒层（CB-GL）。 图5：小脑组织结构 图6：小脑皮质光镜图示 （1.CB-ML 2.CB-PL 3. CB-GL 4.小脑浦肯野细胞PC） ◆ 海马组织： 海马组织结构如图7所示：海马齿状回可分为分子层（DG-ML）、颗粒细胞层和多形层三层结构。 图7：免疫组织化学染色法（A：全脑（红圈圈出海马） B：海马） DGC：齿状回颗粒细胞 DG-ML：齿状回分子层 SLM：腔隙分子层 Hilus：门区 SO：始层 SP：锥体细胞层 SR：辐射层 ◆ TBA细节结果展示： 抗神经细胞抗体可分为两大类，即抗自身神经细胞内抗体和神经元表面抗体。前者为经典副肿瘤综合征抗体，包括抗Hu、Ma2抗体，常伴随小细胞肺癌、乳腺癌以及淋巴瘤等，一般预后较差，抗肿瘤治疗有效，但对免疫治疗不敏感。而后者为新型自身免疫性脑炎，其抗体同时兼具致病性和特异性诊断标志物的性质，代表性自身免疫性抗体为NMDAR抗体、LGI1抗体等，伴或不伴肿瘤性疾病的发生，病程可逆，免疫治疗有效。 下文将展示常见抗体对应的TBA免疫荧光形式：
需要注意的是，低滴度NMDAR抗体容易导致TBA假阴性。
浦肯野细胞层内贝格曼胶质细胞核荧光
浦肯野细胞层，胞质及树突呈强点状荧光
A1：抗体结合于海马软脑膜处星形胶质细胞足突（长箭头）及星形胶质细胞胞体。 A2：小脑不同层次免疫荧光表现：(1) 抗体结合各层星形胶质细胞胞体，白质区域尤为明显；(2) 分子层可见贝格曼胶质特征性放射状染色（虚线箭头）。 GFAP抗体荧光，在小脑TBA中集中在星型胶质细胞，包括常见的星型胶质细胞和贝格曼胶质细胞。星型胶质细胞：形态多样，呈不规则星形，胞体较大，突起分支多，广泛分布于大脑和脊髓的灰质和白质中，与神经元、血管等结构广泛接触。贝格曼胶质细胞：是小脑皮层特有的放射状星形胶质细胞，胞体较小，突起细长且垂直排列，从浦肯野细胞层延伸至分子层，与浦肯野细胞的树突紧密关联。
B1：抗体结合于脑组织及软脑膜内微血管周围具备足突结构的细胞（箭头）。 B2：荧光位于两层分子层交界处，沿血管周围间隙（Virchow-Robin腔）分布（箭头）。
A1：抗体结合于海马内少突胶质细胞。 A2：抗体结合于小脑平行纤维（箭头）和脉络丛（虚线箭头）。 总结 TBA法是检测抗神经细胞抗体的重要方法。由于不同抗体可能呈现相同的荧光形式，TBA需结合CBA才能更明确具体的抗神经细胞抗体，从而有效辅助疾病诊断。此外，通过细致观察荧光特征，有助于判断抗体是针对细胞膜表面抗原还是细胞内抗原，助力临床治疗。 |
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