共识解读丨宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》发表于中华检验医学杂志2021年第44卷第2期，该共识由全国六十多位来自临床和医学检验的专家共同撰写，对宏基因组高通量测序技术在感染性疾病的应用、实验流程、质量管理、报告解读等方面给出了推荐意见和处理方法。一方面，该技术已在感染性疾病的诊断领域中为大家所了解和使用，也为临床解决了很多实际问题，但另一方面，这项病原检测也同其他的新兴检测项目一样，存在着不成熟的地方并给使用者带来了困惑。该专家共识在这样的背景下对如何理性、客观、恰当的使用该项技术提供了很多关键问题的推荐和处理方法，为临床抗感染诊治提供了帮助。  1 相关术语 I. mNGS：m 指宏基因组，是标本中全部生物（人、微生物）基因组的总称。mNGS指对标本中的全部生物基因组进行NGS 分析。NGS：高通量测序。 II. cfDNA：游离脱氧核糖核酸，循环中的cfDNA来源于濒死的人类细胞和定植或侵入的微生物，它们在分解时将核酸释放入血。对于血液的mNGS检测即是对cfDNA的检测，如图1所示。 血液中检出一些病原的cfDNA并不意味着该病原入血繁殖，只是表示其核酸进入血液，比如曲霉，毛霉等真菌，这类病原体本身入血繁殖是罕见的，但是在感染的局灶范围内，在免疫及药物的作用下，病原死亡其核酸是可以入血的。 III. 读长（reads）：测序仪单个测序反应得到的碱基序列。长度为序列的碱基长度，读长数量为获得的碱基序列的数量。报告中的某微生物种属名下的读长数一般为原始序列经过滤后的净读长数量。 读长并不意味着病原体的一个定量指标，检出的序列数并不具有直接的可比性，且不同病原的细胞壁厚度、基因组大小差异较大。不同的标本之间的人源核酸比例也差异较大，即便是相同病原的序列数也不具有直接可比性。 IV. 深度：比对到已知参考序列的碱基平均测序次数。例如，30倍测序深度意味着基因组的每个碱基平均被测了30次，深度越高，检出碱基可信度越高。 V. 覆盖度：指达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比。 VI. 相对丰度：指除去宿主序列之后，某微生物物种序列在相应大类物种（通常分成细菌、真菌、病毒、寄生虫4大类）中的分布比例。丰度越高，表示该物种所占比例越高。  图1. 血液游离微生物脱氧核糖核酸的来源与检测。所检测到的微生物cfDNA具有两个来源，1).微生物（细菌，病毒或噬菌体）易位。例如，在胃肠道中，当肠道微生物过度生长，当肠粘膜屏障通透性增加或宿主免疫防御功能受损时，微生物可进入血液循环。2).当组织粘膜发生局部感染或物理损伤时，侵入性病原体可能会偶然进入血液。这些入侵的微生物可以被抗菌药物及免疫反应杀死并分解，导致微生物核酸产生。血液的mNGS检测即通过在循环系统中捕获和鉴定高度片段化的微生物cfDNA来诊断可能的感染。（图片出处：Theranostics. 2020 Apr 7;10(12):5501-5513.DOI: 10.7150/thno.45554） 2 感染性疾病的适应证 Ⅰ. 临床适应证 共识1 对常规微生物学检查容易明确病原体的感染，如尿路感染通过尿培养手段，不建议mNGS。 共识2 患者表现为发热或发热症候群，病因未明确（符合不明原因发热定义），考虑感染或不除外感染，但规范性经验抗感染治疗无效，考虑应用常规技术检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。 共识3 各种原因导致患者急危重症表现，不除外感染所致，或考虑继发或并发危及生命的严重感染，建议常规检测的同时，或在常规检测基础上，开展mNGS。 共识4 免疫受损患者疑似继发感染，常规病原学检查未能明确致病原或/和规范性经验抗感染治疗无效，建议进一步完善常规病原学检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。 共识5 疑似局部感染，病原学诊断未明确、不及时处理则后果严重（危及生命或会导致局部功能不可逆性丧失）时，考虑常规检测的同时，或在其基础上，开展 mNGS。如眼部（角膜炎/溃疡、眼内炎、急性视网膜坏死等）、鼻部、耳部、喉部感染、糖尿病足、外伤累及深部组织等情况。 共识6 高度疑似感染性疾病，但病原学诊断未明确且常规抗感染治疗无效，建议进一步完善常规病原学检测、处理原发感染灶（如拔去导管、外科引流或拔去引流管、玻璃体切除）、调整经验抗微生物治疗方案的同时开展mNGS。 共识7 慢性感染，或慢性疾病不除外感染，尤其是二者临床表现相似、难以鉴别时，病情严重或抗感染治疗疗效不佳需要明确病因，建议在完善常规检测、调整经验治疗的同时开展mNGS。 共识8 除以上共识2~7 之外的患者人群，不建议无条件普遍进行 mNGS 检测；进行 mNGS 检测前请感染病学和/或临床微生物学专家会诊。 共识9 不建议应用 mNGS 技术评估抗感染治疗效果。 小结 推荐：对于不明原因发热、急危重症、免疫受损、局部感染、疑似感染但常规抗感染无效、慢性感染这6种情况下推荐使用mNGS检测。值得注意的是，该共识强调使用mNGS检测的同时需以常规微生物检测为基础，适用于感染病因不明确且常规治疗无效或感染危及生命的情况下。 不推荐：不推荐用于常规微生物容易明确的感染（如尿路感染）、无条件的普遍mNGS检测和用于评估治疗效果的送检。 Ⅱ. 微生物学适应证 共识10 针对微生物，考虑出现疑似新发病原体，或某特殊病原体，缺乏传统技术或传统技术手段不能确定种属时，建议常规检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。 共识11 临床表现高度怀疑感染性疾病而多种传统技术反复检测不能明确致病微生物，但仍高度怀疑微生物所致，建议继续完善更多检测技术的同时或在其基础上，开展mNGS。 共识12 传统病原学检测的结果不能解释临床表现的全貌或/和抗感染治疗的反应，怀疑同时存在其他病原感染时，建议进一步完善更多检测技术的同时或在其基础上，开展mNGS。 共识13 感染性疾病的病原体已明确或高度怀疑某病原体，临床表现提示该病原体可能具有特殊的毒力表型，需要了解其毒力因子的相关信息时，可以考虑对感染相应临床标本进行 mNGS 物种鉴定的同时，采用mNGS检测毒力基因。 小结 在病原学角度，该共识推荐对疑似新发病原体、特殊病原体；多种传统技术不能明确致病微生物；多重感染且常规微生物检测未能覆盖以及怀疑病原具有特殊毒力因子的情况下使用mNGS检测。mNGS检测并不能替代传统微生物病原检测的首选地位，但可作为补充与印证。 Ⅲ. 耐药学适应证 共识14 感染发生在正常有微生物定植的部位，或检测标本采集有污染时（如支气管肺泡灌洗液），不建议采用mNGS进行耐药性检测。 共识15 感染发生在正常无微生物定植的部位且标本采集过程污染概率低时，可以考虑采用mNGS进行物种鉴定的同时检测耐药基因，并通过耐药表型试验对耐药基因进行验证。对有菌种特异性的耐药性基因，在测序深度足够时，可以考虑应用 mNGS 检测获得性的耐药基因，预测耐药表型。 小结 对正常情况下无菌部位的标本进行物种鉴定的同时可对耐药基因进行检测，需结合耐药表型试验进行验证。菌种特异的耐药学基因在深度足够的时候有一定的预测意义 Ⅳ. 流行病学和感染控制学适应证 共识16 出现某种疾病的聚集性发病或暴发，怀疑是微生物导致的感染性疾病但病原不明，且常规快速检测无结果时，建议完善常规检测的同时或在其基础上开展mNGS明确致病微生物。 共识17 感染性疾病患者有特殊区域（如北美地区有某些致病性真菌）旅居史，或有特殊职业工作史（如畜牧业、屠宰业、水产业等），感染病原未明，建议常规手段检测的同时开展mNGS。 小结 聚集性疾病或暴发；患者有特殊旅居史或特殊职业暴露且病因未明，在完善常规送检的同时建议进行mNGS检测。 3 mNGS的基本流程和管理要求 Ⅰ.标本采集 共识18 从正常无菌部位采集 mNGS检测标本，应严格无菌操作，避免污染；从有菌定植或污染部位采集的标本，应采取必要措施，尽量减少污染；用于宏基因组 RNA 测序的标本，应添加核酸稳定剂。mNGS 标本的运送须防污染、防震荡、冷链快速运送；标本如不能及时检测，应保存于低于-70 ℃ 冰箱或液氮（血液标本应分离血浆后保存）。建议的常用临床标本采集要求和相关说明见表1。  Ⅱ. DNA/RNA提取 共识19 建议实验室的核酸提取流程、病原体核酸提取试剂盒应经过验证；高宿主背景标本提取时应采用经过验证的方法去除宿主细胞或核酸；整个提取过程必须有防污染措施，包括阴性对照和阳性对照等。 4 mNGS应用于感染性疾病的报告解读 共识29 解读报告考虑如下参数：测序质量（是否去除低复杂度、低质量序列，Q20、Q30 等）、读长、特异性读长、覆盖率、深度、丰度、微生物序列的数据量、阈值等。 共识30 mNGS 检测报告中，建议结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，区分无菌部位（血、无菌体液、组织、骨髓等）与正常有菌部位（如呼吸道、尿液、开放性伤口）。确认致病微生物时，应考虑检出微生物是否为感染部位的潜在病原。如脑脊液检出新型隐球菌，呼吸道标本检出结核分枝杆菌、腺病毒、流感病毒，关节液或血液标本检出布鲁菌属，均可认为是致病微生物。注意排除常见定植菌、污染菌与工程菌的影响。 共识31 血浆样本对cfDNA进行mNGS检测时，建议从临床的角度鉴别检出序列属于致病微生物、样本污染、死亡微生物裂解，还是定植菌群所致的一过性菌血症。 共识32 mNGS 报告中常规容易培养的病原菌，建议临床医师结合传统方法，综合判断其临床价值。 共识33 建议对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物，如分枝杆菌属、诺卡菌属、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属与双相真菌）等，即使在检测报告中读长数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证，如特异引物的PCR 或一代测序等分子生物学检测，G 试验，GM试验，曲霉菌IgG抗体或隐球菌荚膜多糖抗原等血清学试验。 共识34 采用mNGS进行病原微生物鉴定的同时，可以考虑检测耐药基因，但需要将耐药基因准确定位到具体的病原体上以明确其临床价值。即通过对 mNGS 测得序列进行具体病原体基因组组装之后，确定耐药基因位于哪个病原体上，位于质粒上还是位于染色体上。 共识35 mNGS 对于新发或少见病原微生物的检出具有重要价值。建议解读报告单前应了解比对数据库的内容，明确其是否涵盖少见病原或新发病原。检出高致病性病原微生物，应及时与临床联系。 共识36 mNGS 结果为阴性，对于排除感染常具有较好的阴性预测值。但对于某些病原微生物，如结核分枝杆菌等，原始样本中含量较少，或核酸提取困难的病原微生物，应考虑 mNGS 检测灵敏度较低，阴性预测性差，并不一定优于PCR等常规检测方案。 共识37 建立 mNGS病原诊断的阈值影响因素较多，包括测序平台、测序流程、标本类型、病原种类、患者状况，目前尚无统一公认的阈值，建议各实验室建立自已的阈值，并在临床工作中加以验证。 共识38 不同病原微生物读长对结果判断的影响：同等条件下（相同微生物，相同标本），如某一微生物检出的读长数量多，为致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因组大小不同（寄生虫>真菌>细菌>病毒），核酸提取效率存在差异［难易程度：病毒<革兰阴性菌<革兰阳性菌（不包括分枝杆菌、需氧放线菌等）<真菌］，致病力也相去甚远，因此不能仅仅依靠读长多少来判断是否感染，建议同时考虑病原微生物种类差异与致病特性。 共识39 mNGS 病原微生物检测结果，建议由具有一定生物信息学知识，并从事临床感染或临床微生物等专业人员，结合患者临床背景、影像学资料、其他的实验室检查结果，综合判断。不加以正确解读与甄别，盲目依据 mNGS报告开展治疗， 必将导致抗微生物药物的滥用。 小结 报告解读结合标本：区分无菌部位（血、无菌体液、组织、骨髓等）与正常有菌部位（呼吸道、尿液、开放性伤口）进行微生物解读。应充分考虑该微生物是否为感染部位的潜在病原。 结合微生物种类与特性：破壁困难的微生物，读长（reads）即使较低也要考虑其为致病菌的可能性，并采用其他方法进行验证。同等条件下，读长（reads）越多，为致病性的可能性就越大，但不同微生物基因组不同（寄生虫>真菌>细菌>病毒），核酸提取难易程度不同（病毒<革兰阴性菌<革兰阳性菌），致病力程度不同，不能仅仅依靠读长判断。 阈值：尚无统一公认的阈值。建立mNGS检测病原诊断阈值影响因素较多，建议实验室建立自己的阈值，并在临床工作中加以验证。 阴性预测值：mNGS检测结果为阴性，对于排除感染具有较好的阴性预测值。但对于某些特殊病原微生物，如结核分枝杆菌等，原始标本含量少，提取核酸困难，其灵敏度不一定优于PCR等常规检测。此外，也需要充分结合标本情况，是否送检为高质量且代表感染部位的标本。 5 总结 病原学诊断是感染性疾病诊断的核心环节，病原宏基因组检测可以覆盖到更为广泛的病原体，无偏向性进行核酸检测，对于疑难、罕见的感染性疾病诊治提供了新的方法与途径。客观理性的评价其临床应用范围，优化样本采集和试验流程，恰当的分析解读对该项技术有着重要的意义，该专家共识对这些方面都有着具体可操作的建议，为其应用提供了方向与指导。 参考文献： 1) 中华医学会检验医学分会临床微生物学组等，宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识，中华检验医学杂志2021 年2 月第44 卷第2 期 2) Dongsheng Han，etc, Liquid biopsy for infectious diseases: a focus on microbial cell-free DNA sequencing，Theranostics. 2020 Apr 7;10(12):5501-5513 |
